一、革兰氏染色法简介

革兰氏染色法（Gram stain）是细菌学上最常用的鉴别染色法，1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。

未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察；染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

二、革兰氏染色原理

革兰氏阳性菌——细胞壁厚，肽聚糖含量高而脂质含量低，乙醇脱色时使肽聚糖的网孔结构收缩从而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁上，呈紫色。

革兰氏阴性菌——肽聚糖含量低，交联松散，壁薄而脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原本滞留的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（番红）染色后又变为复染剂的颜色（红色）。

三、革兰氏染色操作方法

1、准备好革兰氏染色所需试剂、玻片、吸水纸、镊子、接种环、废液缸、洗瓶、去离子水、酒精灯等，待检测的菌株一般应为新鲜的培养物。

2、以酒精擦拭玻片，在酒精灯上干燥后，用接种环挑取一环灭菌的去离子水或生理盐水到载玻片上，挑取少量纯培养物在水滴上涂抺至均匀分散，将涂片在酒精灯火焰上灭活、固定。

3、滴加结晶紫染色液 1-2 滴，染1分钟，用去离子水轻轻从培养物上方流过水洗。

4、待干，滴加革兰氏碘液，作用 1 分钟，用去离子水轻轻从培养物上方流过水洗。

5、滴洗脱色剂（95%酒精），不时摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约 10～20 秒），用去离

子水轻轻从培养物上方流过水洗。

6、待干，滴加沙黄复染液，复染 30 秒。用去离子轻轻从培养物上方流过水洗，待玻片干燥

后镜检。

7、油镜镜检。菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌；呈红色者为革兰氏阴性菌。

四、注意事项

1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

2、选用幼龄的细菌，若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

3、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。